大战绿妖后，性情温和的彼得·帕克(托比·马奎尔饰)强忍心痛拒绝了他今生惟一的至爱玛丽·简(克斯汀·邓斯特饰)，决定用自己瘦弱的双臂肩负起作为“蜘蛛侠”的责任。
两年来，彼得一直忙于应付接踵而来的新挑战：首先，他要学会将超能力使用得收放自如；其次，还得小心翼翼地维持着自己的双重身份，在超级英雄蜘蛛侠和平凡大学生的生活中努力保持平衡。但是双面人的生活十分痛苦，他对玛丽·简的爱火愈燃愈烈，可蜘蛛侠的身份又让他不得不隐匿真情。与此同时，玛丽就像每一个普通人一样有条不紊地继续着自己的生活：她已经实现了自己的演员梦，而且，她的生命中又出现了另一个值得爱的男人--彼得开始认真考虑是否应该放弃秘密身份去大胆表达自己的爱。
另外，彼得的好友哈里·奥斯本(詹姆斯·弗兰克饰)在杀父之仇的驱使下，处处与蜘蛛侠为敌，两个人的关系也因此时刻笼罩在不安中；连一向对他爱护有加的婶婶(罗丝玛丽·哈里斯饰)也开始怀疑他的真实身份。就在彼得疲于奔命的时候，他又遇到了一个强劲的对手--章鱼博士(阿尔弗雷德·莫利纳饰)，于是彼得学会了命运的意义在于接受而不是逃避，他必须拼尽全力去阻止这个疯子的邪恶计划
中学生彼特·帕克自幼父母双亡，他与心爱的梅婶母和本叔叔一起生活在纽约皇后区。彼特过着一个普通的学生生活，在校报担任一名摄影师，暗恋着美丽的玛丽·简·沃森，并经常与死党哈里.奥斯本一起到处游荡。
在一次学校组织的旅游中，彼特和他的同学们参观了一个有关节肢动物的科学展览，期间，彼特被一个转基因蜘蛛咬了一口。不久之后，他发现自已具有了非同寻常的能力：他成了一只力量超凡、身手敏捷的蜘蛛，并且还具有了一种敏锐的超感知“蜘蛛感官”。
彼特首先利用他的能力去挣钱，但是血本无归以后，他牢记心爱的本叔叔的话：“用超人的力量担负起伟大的责任”，他发誓要将自己的一生献给与犯罪行为作斗争。
与此同时，哈里的父亲、军火商人诺尔马·奥斯本(Norman Osborn，威廉·达福饰)，也正在经历他自己的一些变数。一次实验方案出了差错，诺尔马的智慧和力量大增，但也让他陷入了精神错乱。诺尔马现在成为了蜘蛛侠的主要对手——绿恶魔，他将彻底考验年轻的彼特·帕克与犯罪行为作战、帮助无辜人们的誓言。
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